Λειτουργικός Έλεγχος Σπέρματος

Έλεγχος Μακροβιότητας σπέρματος:

Η μακροβιότητα περιγράφει την διάρκεια διατήρησης της κινητικότητας των σπερματοζωαρίων στην πάροδο του χρόνου. Επειδή σπάνια συμπίπτουν χρονικά η σεξουαλική επαφή με την ωορρηξία, απαιτείται το σπέρμα να εμφανίζει υψηλή μακροβιότητα , προκειμένου να επιβιώσει στην αναπαραγωγική οδό της γυναίκας για αρκετό χρονικό διάστημα, προκειμένου να επιτευχθεί η γονιμοποίηση. Ως εκ τούτου, η ανάλυση in vitro της σπερματικής μακροβιότητας μπορεί να παράσχει πληροφορίες που αφορούν στην δυνητική γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος

Έλεγχος «ανθεκτικότητας» σπερματοζωαρίων:

Η αξιολόγηση της ανθεκτικότητας των σπερματοζωαρίων σε συνθήκες έντονου θερμοκρασιακού στρες πλαισιώνει τη μελέτη της ικανότητας επιβίωσης του σπέρματος στην πάροδο του χρόνου και έχει συσχετισθεί με την πρόγνωση της έκβασης της προσπάθειας κλασικής εξωσωματικής γονιμοποίησης (IVF). Σχετικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα μη ανθεκτικά σπερματοζωάρια δεν είναι πιθανό να γονιμοποιήσουν παρά μόνο με τη μέθοδο ICSI.

Η ακεραιότητα και φυσιολογική μεμβρανική λειτουργικότητα των σπερματοζωαρίων αποτελεί χρήσιμο λειτουργικό έλεγχο της ποιότητάς τους και αξιολογείται μέσω της δοκιμασίας Υπο-οσμωτικής Διόγκωσης (Hypo-osmotic Swelling Test – HOS test)

Η τιμή του Δείκτη Υπο-οσμωτικής Διόγκωσης παρουσιάζεται υψηλή στο σπέρμα γόνιμων ανδρών ή ανδρών με φυσιολογική ποιότητα σπέρματος, ενώ αντίθετα εμφανίζεται χαμηλή σε δείγματα σπέρματος με διαταραχή στον αριθμό ή στην κινητικότητα. Έχει συσχετισθεί θετικά με παραμέτρους, όπως η προωθητική κινητικότητα και η ζωτικότητα και αποτελεί έμμεση ένδειξη παρουσίας οξειδωτικού στρες.

Σε ό,τι αφορά στην έκβαση της αναπαραγωγικής προσπάθειας, υψηλές τιμές του δείκτη συνιστούν θετική προγνωστική πληροφορία. Αντίθετα, σε περιπτώσεις παρουσίας χαμηλών επιπέδων του δείκτη, η πιθανότητα in vivo σύλληψης ελαχιστοποιείται. Ακόμα και κατά την εφαρμογή κλασικής IVF, αν και τα ποσοστά γονιμοποίησης δεν φαίνεται να επηρεάζονται, η πιθανότητα εγκυμοσύνης παραμένει χαμηλή. Σε τέτοιου είδους περιστατικά, η υποβοηθούμενη προσπάθεια παρουσιάζει καλύτερα αποτελέσματα με τη μέθοδο ICSI.

Μία από τις σημαντικές λειτουργικές ιδιότητες του σπέρματος είναι η διείσδυση στην τραχηλική βλέννα, η οποία εξαρτάται άμεσα από την κινητικότητα ή/και τη μορφολογία, καθώς και κάποιες κινηματικές παραμέτρους. Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών διείσδυσης παρέχουν:

• Μία άμεση ένδειξη της ικανότητας του σπέρματος να εισχωρήσει στο φράγμα του τραχήλου, το πρώτο βήμα κατά την πορεία του προς τη γονιμοποίηση του ωαρίου και κατά συνέπεια μια εκτίμηση της πιθανότητας επίτευξης φυσιολογικής σύλληψης
• Μία έμμεση ένδειξη της γονιμοποιητικής του δυναμικότητας, λόγω της σημαντικής συσχέτισης της ικανότητας διείσδυσης στην τραχηλική βλέννα με την ικανότητα γονιμοποίησης των ωαρίων

Η αδυναμία του σπέρματος να διεισδύσει στην τραχηλική βλέννα αποτελεί αιτία υπογονιμότητας που μπορεί να προκαλείται από:

1. διαταραχές που σχετίζονται με την κινητικότητα ή/και τη μορφολογία των σπερματοζωαρίων
2. την παρουσία ανοσολογικού παράγοντα, δηλ. αντισπερματικών αντισωμάτων
3. την κακή ποιότητα της τραχηλικής βλέννας

Οι συναφείς εργαστηριακές εξετάσεις, οι οποίες διενεργούνται στο Εργαστήριο Σπερματολογίας περιλαμβάνουν:

• Εκτίμηση της ποιότητας της τραχηλικής βλέννας κατά Π.Ο.Υ.
• In vivo έλεγχο της διεισδυτικής ικανότητας του σπέρματος στην τραχηλική βλέννα μετά από επαφή (Sims-Huhner test)
• In vitro έλεγχο της διεισδυτικής ικανότητας του σπέρματος στην τραχηλική βλέννα
  • Μέθοδο αντικειμενοφόρου πλακός (Kurzrok-Miller test)
  • Έλεγχο επαφής σπέρματος-τραχηλικής βλέννας
• Μέθοδο τριχοειδούς σωλήνα (Kremer test)

Η επιλογή των κατάλληλων κατά περίπτωση εργαστηριακών ελέγχων αλληλεπίδρασης σπέρματος – τραχηλικής βλέννας πραγματοποιείται σε συνεργασία με τον θεράποντα ιατρό.

Η ικανότητα του σπέρματος να υφίσταται ακροσωμική αντίδραση στην εγγύς περιοχή του ωαρίου αποτελεί ουσιώδη προϋπόθεση για τη γονιμοποίηση, γιατί απελευθερώνει ένζυμα τα οποία είναι αναγκαία για τη διείσδυση του σπερματοζωαρίου στο ωάριο. Η διαδικασία αυτή αποτελεί το τελικό στάδιο ωρίμανσης των σπερματοζωαρίων, που ορίζεται ως ενδυνάμωση (capacitation) και επάγεται με την αύξηση της συγκέντρωσης του ενδοκυτταρικού ασβεστίου.

Η τεχνητή πρόκληση της διαδικασίας και η μικροσκοπική παρατήρηση με ανοσοφθορισμό προσδιορίζει το ποσοστό των ζώντων σπερματοζωαρίων, σ τα οποία έχει επέλθει απώλεια του ακροσώματος. Η χαμηλή απόκριση των σπερματοζωαρίων σε αυτή την εργαστηριακή διεργασία έχει συσχετισθεί με χαμηλά ποσοστά γονιμοποίησης in vivo και in vitro.

Ο έλεγχος συνιστάται κυρίως στη διερεύνηση των αιτίων αποτυχίας της γονιμοποίησης ή μακροχρόνιας υπογονιμότητας, ανεξάρτητα από την εικόνα των συμβατικών σπερματολογικών παραμέτρων.

Η παρουσία των αντισπερματικών αντισωμάτων σχετίζεται αιτιολογικά με την υπογονιμότητα σε ένα 9-13% των ζευγαριών που αδυνατούν να τεκνοποιήσουν. Αντισπερματικά αντισώματα μπορούν να εμφανισθούν στον έναν ή και στους δύο συζύγους. Ένας πλήρης ανοσοσολογικός έλεγχος του υπογόνιμου ζευγαριού περιλαμβάνει την εξέταση ανίχνευσης των αντισπερματικών ανοσοσφαιρινών των δύο σημαντικότερων τύπων, IgG και IgA, στα σπερματοζωάρια ή το σπερματικό υγρό και τον ορό αίματος του άνδρα, καθώς επίσης και στην τραχηλική βλέννα και τον ορό αίματος της γυναίκας.

Ο βαθμός παρέμβασης των αντισπερματικών αντισωμάτων στη διαδικασία γονιμοποίησης εξαρτάται από:

• Την κλάση των αντισωμάτων
• Τη θέση δέσμευσης των αντισωμάτων στην επιφάνεια των σπερματικών κυττάρων (τύπο συγκόλλησης)
• Τον τίτλο των αντισωμάτων
• Την ύπαρξη σπερματοτοξικών αντισωμάτων

Οι μέθοδοι ελέγχου που εφαρμόζονται στο Εργαστήριο Σπερματολογίας περιλαμβάνουν:

• IgG – MAR test
• Εξέταση ανεύρεσης αντισπερματικών αντισωμάτων με ανοσοσφαιρίδια απ’ευθείας στα σπερματοζωάρια
• Έμμεση εξέταση ανεύρεσης αντισπερματικών αντισωμάτων στο σπέρμα με ανοσοσφαιρίδια
• Ανίχνευση αντισπερματικών αντισωμάτων στην τραχηλική βλέννα
• Μέτρηση τίτλου αντισπερματικών αντισωμάτων που προκαλούν συγκολλήσεις (Friberg test)
• Ανίχνευση σπερματοτοξικών αντισωμάτων

Η επίδραση της βλάβης του πατρικού DNA στην αναπαραγωγική προσπάθεια έχει συσχετισθεί με δυσκολία στην επίτευξη γονιμοποίησης ή/και με τη δημιουργία κακής ποιότητας εμβρύων. Ο συνδυασμός:

Α. της διερεύνησης της ακεραιότητας της χρωματίνης και
Β. του βαθμού κατάτμησης του σπερματικού DNA

αποτελεί απαραίτητο δείκτη στη διερεύνηση της μακροχρόνιας ανεξήγητης υπογονιμότητας.
A. Έλεγχος ακεραιότητας χρωματίνης

Η χρωματίνη αποτελεί το δομικό σύμπλεγμα του DNA και των πρωτεϊνών, που συγκροτούν το γενετικό υλικό του σπερματοζωαρίου στη μορφή των χρωμοσωμάτων.Η παρουσία αδρής, κοκκιώδους (ανώριμης) ή υπεροξειδωμένης (υπερσταθεροποιημένης) μορφής χρωματίνης αποτελεί ένδειξη διαταραχής στο πακετάρισμα του μορίου του γενετικού υλικού στον πυρήνα των σπερματοζωαρίων, που έχει συσχετισθεί με αρνητικές επιδράσεις στη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος.

ŸB. Έλεγχος Κατάτμησης DNA σπερματοζωαρίων:

Το DNA έχει τη μορφή περιελιγμένης διπλής έλικας, που σταθεροποιείται δομικά από πλευρικούς δεσμούς. Αν οι δεσμοί σπάσουν, τότε η έλικα γίνεται ασταθής. Η δομική αλλοίωση στο DNA του σπέρματος, γνωστή ως Κατάτμηση, αποτελεί μετρήσιμο χαρακτηριστικό της λειτουργικότητάς του, που δεν αντικατοπτρίζεται σε καμία από τις συμβατικές σπερματολογικές παραμέτρους (κινητικότητα, συγκέντρωση, μορφολογία κλπ). Άνδρες με σπερματολογικές παραμέτρους ακόμα και εντός των φυσιολογικών ορίων, ενδέχεται να φέρουν υψηλό ποσοστό κατάτμησης στο DNA των σπερματοζωαρίων τους.

Σύμφωνα με εκτενείς επιστημονικές έρευνες, η ακεραιότητα του μορίου του DNA των σπερματοζωαρίων έχει συσχετισθεί με την ποιότητα ή/και βιωσιμότητα των εμβρύων, κυρίως κατά τα πρώτα στάδια διαιρέσεων (4- εως 8-κυττάρων και μετά). Υψηλός βαθμός Κατάτμησης του σπερματικού DNA συσχετίζεται με αρνητική έκβαση της αναπαραγωγικής προσπάθειας, ανεξάρτητα από τη μέθοδο γονιμοποίησης των ωαρίων (φυσιολογική, IUI, IVF, ICSI), μέσω:

• ŸΤης μείωσης της γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων
• Της αναστολής ανάπτυξης των εμβρύων
• Της μη επιτυχούς εμφύτευσής τους (αποβολής).

Οι κύριοι παράγοντες, οι οποίοι ευθύνονται για την παρουσία υψηλών επιπέδων κατάτμησης στο DNA του σπέρματος, είναι:

• ŸΗ έκθεση σε χημικές-τοξικές ουσίες, ακτινοβολία ή υψηλές θερμοκρασίες
• Η ατμοσφαιρική ρύπανση
• Η χρήση φαρμάκων
• Η παρουσία κιρσοκήλης, καρκίνου όρχεων, φλεγμονής ή υψηλού πυρετού
• Η αυξημένη θερμοκρασία των όρχεων
• Το κάπνισμα
• Η κακή διατροφή
• Η προχωρημένη ηλικία του άνδρα
• Οποιαδήποτε διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την πρόκληση οξειδωτικού στρες.

Ο προσδιορισμός του Δείκτη Κατάτμησης DNA σπέρματος συνιστάται κυρίως σε περιπτώσεις:

• Ανεξήγητης υπογονιμότητας μεγάλης διάρκειας
• Χαμηλών ποσοστών γονιμοποίησης ή δημιουργίας εμβρύων κακής ποιότητας σε κύκλους IVF
• Αποτυχίας εμφύτευσης μετά από IVF
• Καθ’ έξιν αποβολών
• Μακροχρόνιας παραμονής σε περιβάλλον με τοξικούς για τη γονιμότητα παράγοντες
• Ολιγοασθενοτερατοζωοσπερμίας
• Προχωρημένης ηλικίας του άνδρα

Επιπλέον, πλαισιώνει κάθε πλήρη έλεγχο του γονιμοποιητικού δυναμικού του ανδρικού παράγοντα κατά τη διερεύνηση υπογονιμότητας. Ιδιαίτερη χρησιμότητα έχει η διενέργεια του ελέγχου κατά:

• την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας ενισχυτικών για το σπέρμα εφαρμογών που συνίστανται σε αντιοξειδωτικά σχήματα
• μετά από χειρουργική αποκατάσταση κιρσοκήλης
• κατά την αξιολόγηση της σπερματικής ποιότητας σε άνδρες που έχουν υποβληθεί σε ισχυρές κυτταροτοξικές θεραπείες.

Οξειδωτικό Στρες Το οξειδοαναγωγικό σύστημα ρυθμίζει την ισορροπία της δράσης των οξειδωτικών και αναγωγικών παραγόντων με βάση τις φυσιολογικές ανάγκες του οργανισμού. Στους άνδρες οι οξειδωτικοί παράγοντες (π.χ ROS) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη σπερματογένεση, στην κινητικότητα και “ενεργοποίηση” των σπερματοζωαρίων καθώς και σε άλλες λειτουργίες.

Οταν η παραγωγή οξειδωτικών παραγόντων ξεπερνά τις φυσιολογικές ανάγκες του οργανισμού και η ποσότητα των αντιοξειδωτικών δεν επαρκεί για να επέλθει ισορροπία, δημιουργείται οξειδωτικό στρες το οποίο σχετίζεται με μειωμένο αριθμό σπερματοζωαρίων, χαμηλή κινητικότητα και λειτουργεί ως δείκτης της ποιότητας του ανδρικού σπέρματος.

Η μέτρηση του οξειδοαναγωγικού δυναμικού (sORP) είναι σημαντικό να γίνεται καθώς είναι ενδεικτική για την αναγκαιότητα ή μη αντιοξειδωτικής αγωγής στον εξεταζόμενο.

Προσδιορισμός ελαστάσης:
Η παρουσία φλεγμονής στην ανδρική γεννητική οδό είναι μία από τις αιτίες που προκαλούν υπογονιμότητα, χωρίς να εμφανίζει πάντα σαφή κλινική εικόνα, κυρίως όταν η συγκέντρωση των λευκοκυττάρων στο σπέρμα υπολείπεται του 1×10⁶ /ml.  Σε τέτοιες περιπτώσεις, η αξιολόγηση των επιπέδων ελαστάσης πολυμορφοπύρηνων μπορεί να αποτελέσει χρήσιμο δείκτη ασυμπτωματικής φλεγμονής του ανδρικού γεννητικού συστήματος.

Αυξημένη συγκέντρωση ελαστάσης προκαλεί:

• μειωμένη ζωτικότητα στα σπερματοζωάρια
• αυξημένη κυτταρική νέκρωση
• δυσμενή αποτελέσματα στην έκβαση της αναπαραγωγικής προσπάθειας, που σχετίζεται με χαμηλά ποσοστά ανάπτυξης βλαστοκύστεων, αυξημένα ποσοστά αναστολής ανάπτυξης των εμβρύων και υψηλή παρουσία εμβρύων κακής ποιότητας, ακατάλληλων για εμβρυομεταφορά ή κρυοσυντήρηση.

Αποτελεί ευαίσθητο και ακριβή διαγνωστικό δείκτη για την αξιολόγηση της δυνατότητας βελτίωσης της σπερματικής ποιότητας μετά από αντιβιοτική θεραπεία. Ακόμα και στην περίπτωση που η καλλιέργεια σπέρματος μετά την αγωγή έχει αρνητικό αποτέλεσμα, η συνεχιζόμενη παρουσία υψηλών επιπέδων ελαστάσης δείχνει ότι η πιθανότητα βελτίωσης των σπερματολογικών παραμέτρων παραμένει χαμηλή.

Σε συνδυασμό με άλλους διαγνωστικούς ελέγχους, όπως η συμβατική ανάλυση, ο μικροβιολογικός έλεγχος, οι έλεγχοι οξειδωτικού δυναμικού σπέρματος, δίνει εμπεριστατωμένες πληροφορίες σε περιπτώσεις διερεύνησης και θεραπευτικής διαχείρισης υποκλινικής λοίμωξης/φλεγμονής της ανδρικής γεννητικής οδού.

Η επιτυχία μίας προσπάθειας υποβοηθούμενης αναπαραγωγής εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ικανότητα επιλογής των καλύτερων ποιοτικά σπερματοζωαρίων. Το σημείο αυτό παίζει σημαντικό ρόλο, κυρίως κατά την εφαρμογή της μεθόδου ICSI, όπου επιλέγονται μεμονωμένα σπερματοζωάρια τα οποία εγχύονται απ’ευθείας στα αντίστοιχα ωάρια.

Σύμφωνα με πληθώρα σύγχρονων μελετών, τα ώριμα, λειτουργικά σπερματοζωάρια που είναι ικανά να συνδεθούν στην διαφανή ζώνη του ωαρίου, εμφανίζουν επίσης ικανότητα πρόσδεσης σε ειδικά πολυμερή υαλουρονικού οξέος. Ως εκ τούτου, η δοκιμασία πρόσδεσης των σπερματοζωαρίων σε πολυμερή υαλουρονικού οξέος παρέχει στον κλινικό ιατρό τις αναγκαίες πληροφορίες για την επιλογή της κατάλληλης μεθόδου υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (IUI, IVF, ICSI) με στόχο την βελτιστοποίηση της πιθανότητας επιτυχίας.

Πρόκειται για έναν εργαστηριακό έλεγχο, ο οποίος ταυτοποιεί το ποσοστό των καλύτερων ποιοτικά σπερματοζωαρίων που περιέχονται στο σπέρμα του εξεταζομένου και προκρίνονται για χρήση σε υποβοηθούμενη μέθοδο με:

• σημαντικά χαμηλότερη συχνότητα δισωμιών και διπλοειδιών
• χαμηλά ποσοστά κατάτμησης DNA
• λιγότερα κυτταροπλασματικά υπολείμματα
• λιγότερες ιστόνες και αποπτωτικούς δείκτες
• αυξημένη παρουσία μορίων-δεικτών κυτταρικής ωρίμανσης
• καλύτερη κινητικότητα και μορφολογία κατά Tygerberg.

Το 10% των υπογόνιμων ανδρών διαγιγνώσκεται με αζωοσπερμία. Ως αζωοπερμία ορίζεται η πλήρης απουσία σπερματοζωαρίων στο σπερματικό υγρό.
Η κλινική αυτή κατάσταση απαιτεί είδική διερεύνηση και θεραπευτική στρατηγική.
Η αζωοσπερμία διακρίνεται σε αποφρακτικη και μη αποφρακτική. Η διάκριση αυτή μεταξύ των δύο κατηγοριών είναι καθοριστική τοσο για τον ίδιο τον άνδρα όσο και για τον κλινικό ιατρό για την περαιτέρω διαχείριση του κάθε περιστατικού.
Η χρήση των βιοδεικτών τα τελευταία χρόνια παρουσίαζει πλεονεκτήματα στο κομμάτι της διάγνωσης και της επιλογής κατάλληλης θεραπείας.
Ως βιοδείκτες ορίζονται μόρια σε ένα βιολογικο σύστημα με προγνωστική αξία. Οι διαφορές στη συγκέντρωση τους συνδέονται με διαταραχές στην εύρυθμη λειτουργία του συστήματος αυτού.
Η χρήση των βιοδεικτών στην διερέυνηση της ανδρικής υπογονιμότητας αποτελεί μια καινοτομία.
O βιοδείκτης ECM1 είναι μια πρωτεϊνη που εκφράζεται σε μεγάλη συγκέντρωση στον ιστό της επιδιδυμίδας. Συντελεί στην διατήρηση της ακεραιότητας του ιστού μέσω αλληλεπίδρασης με ποικιλία δομικών και εξωκυταρικών πρωτεϊνών. Η μέτρηση των επιπέδων του βιοδείκτη ΕCM1, που πλέον μπορεί να διενεργηθεί σε ένα ανδρολογικό εργαστήριο, συντελεί στο διαχωρισμό της αποφρακτικής απο την μη αποφρακτική αζωοσπερμία.
Δεδομένου οτι η ανάπτυξη χειρουργικών τεχνικών λήψης σπερματοζωαρίων απο το ανδρικό γεννητικό σύστημα δίνει τη δυνατότητα απόκτησης απογόνων, σε αζωοσπερμικούς ανδρες η εξέταση των επιπέδων του ECM1 μπορεί να αποτελέσει σημαντικο εργαλείο για τη λεπτομερή διερέυνηση και σωστή διαχείριση αυτών των περιστατικών.